核酸抽提的推行 – 核酸抽提实验部分问题的 Case StudyCase；一次抽提抽提基因组 DNA，电泳时却发现，唯有大量小片断 RNA，而基因组 DNA 简直无，故祛除。第二天早上，意外中又看了一次仍然放在电泳槽中的胶，发现基因组 DNA 相配亮，而小片断 RNA 如故莫得了。Study：电泳开动后，核酸前行，胶中加入的EB 赶巧相悖是往后行的。小片断的核酸跑得快，是以先与 EB 皆集，后头的大的核酸片断，只可与“漏网”的 EB 皆集。要是小片断的量太大，在一定时间内，小片断简直将通盘全部的 EB 全部皆集掉了，后头的大的片断就莫得契机与 EB 皆集，是以就出现了小片断相配亮，而大片断消除/很弱的自豪。放在电泳槽中过夜的经过中发生了如下的变化：EB 最终均匀地散播在溶液及胶中，胶中的大片断基因组 DNA 扩散慢，仍然处在胶中，被 EB 饱和，而小片断扩散出胶，干与溶液中，是以消除。可能适用问题：1：RNA 抽提，电泳发现 5S 相配亮，而 18S/28S 很弱/看不见 (有一个战友故意作念过这方面的实验，有相片，相配直不雅。)。2：基因组 DNA 抽提，电泳只看见大量小片断 (RNA)，看不见大片断。3：任何多片断电泳，当小片断相配亮时，大片断就可能不够亮 (尽管它存在)。最通俗对策：用 EB 溶液补染 15-30 分钟。Case：一次用肝脏抽提总 RNA，TRIzol 法，1/2高盐 + 1/2 异丙醇千里淀。千里淀离心后，倒掉上清，偷懒，顺利加入75%酒精；混匀后发现存点耻辱。离心后，千里淀变大。再洗涤，干燥后，加水熔化。大部分快速溶掉了，极少不溶。另外一个样品，千里淀离心后，倒掉上清后，将离心管放入离心境一刹离心；再用移液器将残留的液体透顶吸出，方加入 75% 酒精洗涤及以后要领，边界相配正常。Study：加入 75% 酒精后千里淀变大，最初不错交融的是，千里淀决不可能来自 75% 酒精，相似，也不可能来自底本的千里淀自己；惟一可能的开头是莫得倒干净的上清。千里淀是什么并不是最伏击的，伏击的是为什么残留的上清在加入 75% 酒精后出现千里淀：上清的醇浓度为 25%，加入 75% 酒精后醇浓度大大高潮，边界，那些在低醇浓度时可熔化而高醇浓度不熔化的物资就千里淀了出来。可能适用问题：一切加入 75% 酒精后千里淀变大许多的自豪，尤其是使用异丙醇千里淀时。Case：用 100bp，200bp，…，1kb，2kb，…，10kb 的 Ladder 模拟胶回收据件，而况刻意使用了更可能导致变性的条目ai 人妖，想看一看为什么变性以及如哪里罚；不幸的是 Ladder 等于不变性ai 人妖，我也就莫得材料进行下去了。Study：该“失败”的实考据明：胶回收经过中使用的溶液等ai 人妖，在圭臬胶回收据件下，自己不是导致片断变性的罪魁罪魁，以致不会导致片断的变性。片断要是发生变性，更可能因为片断的两条链不是悉数准确匹配的，也等于 PCR 经过中的错配所致。可能适用的问题：片断胶回收后变小了 (因为形成了单链)。谢谢上海孤儿!!!!我会试一下，然后将边界反馈总结的.学习学习，交流交流to 上海孤儿左证你的处罚决议我实验了一下，的确底本看不到的大片断走漏了出来，尽管相配的淡，而且向下弥漫降解，200bp支配仍然有相配亮的条带，不知谈这样可不不错作念PCR。我作念的丝状真菌的DNA索取1菌丝过滤干燥，液氮研磨2加2倍的CTAB缓冲液65度温育30min3酚氯仿异戊醇抽提，氯仿异戊醇抽提4 加2倍无水酒精-20渡过夜5 70%酒精洗两遍6 加TE熔化我底本等于用这个措施苛刻来的而且相配的好，目下我提好几次都是DNA降解的横蛮，沉闷！！！想换措施，然则换了后还要再揣摩条目！！这种事情随机候也发生在咱们 实验室其他东谈主身上，相似的东谈主相似的措施相似的菌，等于时间上的不同，随机就若何也提不出来！不知谈 上海孤儿 和浩大园友们若何看待这个问题。或者该若何优化上头这些要领！to sunlei:我以为有两个方位最佳校正：要领 2 之后，加多一步高速离心去除千里淀，不错大大缩小多糖残留；要领 4 不要 -20 过夜，最多 1 小时，以致室温 20 分钟，也不错减少多糖残留。千里淀用室温 20 分钟的平允是：离心后，要是有千里淀，就链接往下作念，否则，相似不错再抛弃到低温条目链接千里淀的。一个更大的变化来自 Biotechniques 1995 (vol.19， No.3)：摄取 37C 温浴 45 分钟；抽提过的上清用 0.7 倍体积的异丙醇千里淀 (4C 30 分钟)。边界是得率比 65C 加多一倍。巯基酒精加了？CTAB 施展莫得问题 (有东谈主认为 CTAB 不是每批都顺应提核酸。)? 另外，降解不错这样部分处罚：液氮刚刚蒸发干时，快速研磨几下，再加液氮；如斯反复，知谈研磨得相配细。至于能否用于 PCR，枢纽应该是在残留的多糖量。相似的东谈主相似的措施相似的菌，等于时间上的不同，随机就若何也提不出来！这个问题我也遇到，而且多在我忻悦的时候。如故与操作更关连络一些。谢谢楼主，您的总结对我的匡助真的很大。我才刚刚作念了3个月的RNA索取，对许多东西了解的不是很明晰。经您这一总结成绩颇丰。to 上海孤儿:谢谢上海孤儿的建议!有一个方位我不解白，你说的要领2后高速离心去除千里淀我不太明显，是留住离心后的千里淀?如死去除千里淀留住裂解液呢?要是是去除高速离心后的千里淀的话，那么大部分DNA也会在千里淀中啊!另外我会预防你说的其他几点，翌日再好好提吧，但愿群众的实验都会奏凯!!to sunlei1981: 抱歉地说，我看了你的这个帖，确实忍不住，笑了。是核酸抽提生人？要领 2 CTAB 裂解后，要是裂解悉数，核酸应该是干与溶液的，离心后，千里淀 (残渣) 不要，保留上清 (其中含 DNA)。要领 3 是对上清进行抽提。另外，顺应扩大一丝 CTAB 液的用量。是的，底本提DNA，都是很迷茫的不好情理啊....看完毕通盘的帖子，深有感概，一个字“牛”，两个字“真牛”，三个字“太牛了”，哈哈，笑话。刚好我亦然刚开当作念考试，作念的是索取泥土总DNA，看了楼主的帖子，受益良多，也有一些问题求教。一：在前边楼主提到在醇千里淀DNA时7000rpm就不错把DNA离心下来，但许多著述中提到在第一步裂解细胞后离心就用到6000和7000rpm，20分钟，然后取上清进行酚氯仿抽提，那这样的话不是有一部分的DNA亏空掉了？现实上我亦然搞不明晰到底第一步用些许转离心好，莫得一个分界线吗？也灵验4800的，但大多是6000。二：我所索取的DNA方针是用来建宏基因组文库，其中含有一些RNA，固然我苛刻的DNA还需要用试剂盒来纯化（含有许多腐殖酸等），是不是纯化回收以后就莫得什么RNA了？我看了其它的著述，都莫得对它进行再处理。敬请赐教，多谢！to zhouyakui:第一个问题：细胞裂解后，平方的速率是弗成使核酸千里淀下来的，但不错去除大的杂质；要是想从裂解的样品中千里淀下核酸，就需要加入醇。第二个问题：对我来讲，一个字“难”，两个字“真难”，三个字“太难了”。我根蒂莫得作念过这样的样品，不敢妄加探究。我不错给的建议是：RNA 的残留不要放在心上，重心去除腐殖酸等；在此经过中，RNA 一定早就被意外间被去除了。TO 上海孤儿 我是一个核酸抽提生人，想求教一下上海孤儿我的抽提经过和试剂是否使用妥当！！！我提的是小鼠肠谈细菌的总DNA，作念一个各样性磋议，用了两种措施：1.肠谈内容物用TE 悬浮，80度灭活，加溶菌酶37度温浴2小时，再加卵白酶K50度温浴过夜，再抽提.千里淀。2.肠谈内容物用DNA索取缓冲液（0.1M Tris-Cl，0.1M EDTA-2Na，0.1M 磷酸盐PH8.0，1.5M NaCl，1%CTA悬浮，加20%SDS和卵白酶K温浴过夜，后头一样。目下我又配了另一种DNA索取液：0.01MTris-Cl，，0.1M EDTA-2Na，5g/LSDS)请上海孤儿务必指引一下呀，相配感谢！！！！！！to 潇潇1983:没作念过。要是是我，我会采选以 1 为基础的措施，因为溶菌酶的使用不错确保部分 Gram+ 菌的 DNA 被抽苛刻来。最初，我会这样作念：肠谈内容物用TE (pH 8.5) 悬浮，离心；再用 TE 洗涤 2 - 3 次，确保体系 pH > 8.0。加溶菌酶 37 度温浴2小时，再补加 SDS 到终浓度 1%。再加卵白酶K50度温浴 2 小时，再抽提，千里淀。TO 上海孤儿 看了你的留言了，相配感谢！！！TO 上海孤儿 我一般是加了卵白酶K以后都是温浴过夜，好像有十五个小时（等于下昼7、8点作念完前边的就温浴，然后第二天早上再来用酚抽提），上头你说温浴2个小时，我想问一下温浴时间的曲直对核酸的抽提影响大吗？TO 上海孤儿 我一般是加了卵白酶K以后都是温浴过夜，好像有十五个小时（等于下昼7、8点作念完前边的就温浴，然后第二天早上再来用酚抽提），上头你说温浴2个小时，我想问一下温浴时间的曲直对核酸的抽提影响大吗？to qqc117875124：过夜莫得问题，以致平允更大。然则，过夜处理，温度一般用 37C 为好。50C - 65C 是 PK 更顺应的消化温度，但失活也更快，是以该温度一般用于快速消化 (2 小时内)。有东谈主这样作念： 50C 一小时后，37C 过夜。最枢纽的是，在消化的头半小时，一定要时时混匀体系。to 上海孤儿“含 CTAB 的裂解液，简直成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解措施。该措施奏凯与否与两个因素关连：一是 CTAB 的质地，二是洗涤的透顶进度。CTAB 的质地对裂解效劳有很大的影响，而且，似乎还说不明晰原因，因为即使是吞并公司坐褥的纯度一样的 CTAB，批号不同，后果就可能别离很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同期， CTAB 的极少残留也会对酶活性有巨大影响，是以洗涤是否透顶亦然该措施奏凯与否的枢纽。裂解时的温度，多使用 65C；但要是发现降解严重或者得率太低，不错试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。”读了你这段话，有两个不懂的方位，想求教你一下：1.CTAB的洗涤是什么情理，我用的DNA索取缓冲液（上头有提过）中含了由CTAB，然则加了SDS和PK后就顺利用酚抽提了，是以不懂这个洗涤是什么情理。2.裂解的温度，我等于用的PK的温度，50度，是否要裂解一段时间再加PK呢？TO 上海孤儿 感谢你上头给我的建议，一直有着温浴时间和温度的困扰，目下终于明显了。谢谢了！！！！to qgc117875124:1：洗涤等于指 75% 酒精的洗涤。CTAB 的残留对后续实验的影响是相比大的，同期，CTAB 也不是容易去除的，因为 CTAB 有与核酸皆集的才略。2：一般讲，使用 CTAB 的操作，就不会再使用 PK 了，你若何都使用？颠倒的样品？固然，使用了也不应该有坏处，最多耗损。3：你的问题 2，最初请参考我的回话 2。要是你的样品必须再使用 PK，那么：要是你的操作，在加入了含 CTAB 的裂解液后，有一段时间的温浴，则在后头不错顺利加入 PK 消化；否则，在加入 PK 前 15-30 分钟的温浴，是有匡助的。TO 上海孤儿 我是看汉典这样写的（qgc117875124 是实验室一同学的，今天早上借用了一下）。我是个生人，才战争这一方面的东西，我真的不知谈用了CTAB后就不需要加PK了，我是看了你的帖子说CTAB对酶的活性有影响（不加PK是因为这个原因吗？），是以才对这个措施有点猜疑。真的谢谢你啊，否则我就一直耗损下去了哦，PK如故蛮贵的哦！！！！ 我今天提DNA出现了一个自豪不是很交融，等于临了千里淀的时候，离心下来是一黄色物资包着一白色物资的紧实的千里淀，用75%的酒精洗了两次也洗不下来，后头用TE溶，溶得很慢，然则白色的溶了，剩下黄色的油状东西铺在管底的，不是很交融这个黄色物资，醇也不溶，水也不溶！！！！而且不明晰这个黄色物资是什么东西？to 潇潇1983:1：CTAB 残留对后续酶反馈的酶有影响，指的是对 Taq 或者内切酶有影响。CTAB 抽提后不使用 PK，只是因为莫得必要。PK 是一个相配颠倒的酶，对它，CTAB 应该不会有相配大的影响。2：你的样品颠倒，是以，我弗成给出忖度。我预防到你永恒莫得提到电泳的事情。电泳是不错提供一些信息的。建议你先将“溶”好的东西高速离心 5 分钟，取上清到另外一个离心管中；从中取极少电泳，看一看是否含基因组 DNA。(最起码，你要知谈你抽提的 DNA 在什么方位吧；尽管白色可溶的似乎更像是 DNA，但你先要阐述。) 要是相配红运，电泳不错看见 DNA，那你最起码目下先不要去了解黄色物资是什么；上清中的 DNA 是否不错不经进一步纯化而顺应你的后续实验，是下一步该作念的实验。等你作念完毕，你也许就健忘了黄色的不溶物了。相配感谢楼主，成绩很大！我最近看***的一个纪录片是讲对南亚海啸死难者身份果决的，其中有一块就讲到了从死尸中索取DNA的用全血索取DNA后，用TE液保存为何要过夜，武艺进行下一步操作，有莫得相比详备的解释？谢谢了！一直以来，我都在进行着抽提RNA的实验，而其中最让我祸殃的等于每次用DEPC水来灭活EP管，TIP头的职责.今天看到海上孤儿的妙招，有一种相遇恨晚的嗅觉.相配感谢您的措施，即日的实验，我就会来尝试.呵呵，真有一种期待.望望后果如何.你好，求教一下什么是两步PCR？等于说，在95度预变性5分钟后，然后：touchdown cycles of 95 °C for 30 s， annealing at 64–52 °C for 30 s and72 °C for 30 s， decreasing the annealing temperature by 2 °C every other cycle for 14 cycles then 30 cycles of holding the annealing temperature at 50 °C;他这样作念的方针是为了什么呢？这个需要什么类型的PCR才不错作念呢？还有我看到一双引物的正向引物的退火温度和反向引物的退火温度是不一样的那若何去瞎想我方的退火温度呢？相配感谢您的回话：）to zwjlynn: "用全血索取DNA后，用TE液保存为何要过夜，武艺进行下一步操作"。这不错认为是你被误导或者你的交融造作。过夜的方针是确保 DNA 的悉数熔化。要是短时间能熔化，过夜作念什么？即使莫得悉数熔化，要是你的 DNA 是用于 PCR 模板，为什么要过夜？论断是：不一定非要过夜，但要是 DNA 难熔化，过夜会有匡助 (包括 65C 助溶也会有匡助。同期，即使过夜熔化，随机仍可能遇到还不熔化的东西。这时，离心后取上清，但上清是否能用于后续实验，只可自行实验。to lyq1096：看了你的帖，更刚烈了我更名字的决心。我除了核酸抽提技艺之外，其它的都唯有书册学问，自谓不懂。相配抱歉。to lyq1096：看了你的帖，更刚烈了我更名字的决心。我除了核酸抽提技艺之外，其它的都唯有书册学问，自谓不懂。相配抱歉。 你好，不外还曲直常感谢我在这也学到了许多的东西，而况是大多在教材学不到的，相配感谢不外我还有个问题想求教下：）我去野无邪物的样品在作念DNA索取中，我遇到了这样的情形不知谈是否应该取样：一个老乡给我说他家有我需要的样品，然则用食盐把肉给盐起来了，表面上说是只是细胞失水辛苦是呀？然则我也不确信在这样的情况下是否还能索取出来质地好的DNA呢？谢谢您的回话to lyq1096:从盐肉中要是能抽苛刻完满的 DNA，那岂不是有了保存样品的好见识了？不外苛刻 DNA 不会有问题的，然则片断有多大就不可先见。这应该不是问题吧，要是片断小，你不错瞎想出小一丝的方针居品等于。先买下来老是莫得错的。用Qiagen Tips 100索取质粒后，我用无水酒精保存。使用的时候用75%的酒精洗涤，然后用水熔化备用。有一次，我错用了25%的酒精（因为是现用现配）洗涤，是以想，洗涤的时候是否不错用25%的酒精洗涤（25%的酒精不错悉数熔化质粒千里淀）？因为楼主和汉典中都说要将千里淀悬浮。洗涤后用75%的酒精千里淀，这样洗涤是否可取？是否这样洗涤能够将杂质、其它有机溶剂更好去除 ？TO 上海孤儿 : 我准备师法别东谈主索取白细胞DNA（东谈主的）：裂解液（Nacl 100mmol/L， Tis-cl 10mmol/L， EDTA 0.5mmol/L， SDS 0.5%)；索取要领为：1)清新抗凝血加入0.83%NH4Cl洗两次，4000prm10分钟，弃上清。2)千里淀中加入700ul细胞裂解液，充分打散，加2mg/ml的卵白酶K50ul混匀后（混匀看有莫得粘液样，如有则施展DNA不少），37℃过夜或56℃3h。3)加等体积酚，混匀以去除卵白，室温 10000 prm 10分钟。4)取上清，再加酚/氯仿（1：1）1ml相通提两次，混匀，室温 10000 prm离心10分钟。5)取上清，加0.2ml 3MNaAC混匀，加两倍体积冰酒精，可见DNA析出，室温 10000 prm离心10分钟，6)弃上清，用75﹪酒精洗两次。7)弃上清，室温干燥千里淀，加入TE熔化DNA。冰无水酒精-20℃保存，临用前离心千里淀干燥后用。配制裂解液时：1.顺利用Tis代替Tis-cl ，EDTA-Na2代替EDTA可行？ 2.上述裂解液的因素偏抓浓度可需校正？索取时：3.上述各要领描画是否正确？4."酚/氯仿（1：1）"的作用？5.上述裂解液及索取要领，能否用于G-菌菌液索取DNA？ 多谢群众赐教！to myf1978:最初谢谢您的 email。看后元气心灵充沛，是以脸是红的。这也对应了我的舍即是得的愿望。(改版后一时找不到回 email 的方位了。)对于洗涤时酒精的浓度。70%-80% 酒精洗涤应该是一个被平方的实考据明的合适浓度。所谓合适，包括两个方面：核酸的损结怨残留杂质的去除效劳。在交流的而且一刹的时间内，酒精浓度越低，洗涤效劳确信越高；然则，那时间充足万古，洗涤效劳不会有什么区别的，因为残留的杂质大部分都不错熔化于 70-80% 的酒精中。悬浮千里淀的方针，现实上是为了使千里淀中的盐浓度与 75% 酒精中的盐浓度更快地达到均衡。我莫得作念过低浓度酒精洗涤的实验，因为它似乎会相比复杂，与核酸片断的大小会关连络。要是不是莫得见识，如故松驰不要使用低浓度酒精洗涤吧，因为75% 酒精悉数不错达到闲散的后果的。to 晏子:1：裂解液中 Tris 和 EDTA 用什么替代不是问题，但一定要确保配制好的裂解液的 pH 值不小于 7.8。2：裂解液的配方不错使用的。也有一些隐微不同的配方，但不影响边界。3：要领 2 加入 PK 消化后的蕃昌度，才是 DNA 量的些许的一个预计筹算。4：等体积 PC 的抽提，如故为了去除卵白质，但同期不错减少单纯使用苯酚时的高苯酚残留。5：不错。但建议在加入苯酚抽提前，先离心去除千里淀。同期，要有念念想准备，那等于可能会有极少多糖残留。上海年老，前段时间，我看到有论文提到用煮沸法索取基因组DNA，而且后果很好，能弗成对动物组织DNA煮沸法索取给点建议阿？谢谢我是别称入门者，想请问DNA稀释缓冲液和10%的SDS液的作用和作用旨趣永别是甚么?能否略略具体地奉告一下，谢谢了!糗百还有成人版

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